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HPLC法测定大黄中游离蒽醌的含量

来源：985论文网添加时间：2020-05-14 11:38

摘要

目的:采用HPLC法测定大黄中游离蒽醌的含量。方法:采用HPLC法。结果:大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄含量各不相同,通过建立HPLC法测定含量的数学模型,找出影响不确定度的因素,计算合成不确定度,给出扩展不确定度和置信水平。结论:该方法简单迅速，结果准确，精密度好，对游离蒽醌的含量测定能更好的控制双黄连口服液的质量,该方法可作为大黄药材的质量控制方法。

关键词：大黄；蒽醌；HPLC法

1绪论

1.1研究背景与意义

大黄为临床常用的泻下药，用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽，湿热黄疽，血热吐衄，目赤，咽肿，肠痈腹痛，痈肿疔疮，瘀血经闭，跌扑损伤，外治水火烫伤；大黄为寥科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtauguticumMaxim.exBa1f或药用大黄RheumofficiualeBaill.的干燥根及根茎，大黄属常用中药,其主要成分是蒽醌及其衍生物,其中HPLC法是测定蒽醌的较为常见的方法。大黄中富含蒽醌类衍生物，含量约为3%-5%，其中包括蒽醌普及蒽醌普元等，而蒽醌普类成分是大黄泻下的主要药效成分之一，它与大黄的主治功能密切相关，且蒽醌类成分具有抗菌消炎等作用。同时也包含了两个大黄苯乙烯，甲基乙基酮，柔苯等化学成分。大黄目前对于大黄药材的质控多以酸水解法制备提供试品溶液。据文献报道，蒽醌类化合物是大黄的主要有效成分。作者在对大黄系统的化学成分研究的基础上，分离得到了芦荟大黄素-8-O-β-D葡萄糖普(aleo-emodin-8-O-β-D-glucopyr-anoside)大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷(rhein-8-O-β-D-glucopyranoside)[1]。高效液相色谱洗脱的方法研究了两个不同中药大黄蒽醌类成分的含量测定。该方法色谱峰分离度好，制定科学、可控的质量评价标准为色谱峰分离提供了科学依据。为了更精确的测定大黄不同工艺提取物的蒽醌含量，本文分步提取其中的游离黄醌和结合蒽醌，并采用HPLC法进行测定。

1.2研究现状分析

近来，随着对HPLC技术研究的进展，通过提升和改进测定方法，使其日趋走向完美。郝晓花等人在以前的基础上，改变了过去需要花费较长的测定时间、处理样品比较复杂等诸多缺点的含水反相液相色谱法，而是采用非水RP-HPLC法（优点是：样品预处理步骤被简化，同时采用乙醚分次提取，与一次性用乙醚提取相比，明显的提高了提取的回收率），测定活性蒽醌类成分在血浆中的含量。如此运用HPLC就可以大大地缩短分析时间，而且较快速、准确、简便，同时色谱峰也比较对称，结论，适用于蒽醌类成分的含量测定。

郝淑清等用双波长薄层扫描法对3种方法溶出的蒽醌衍生物含量做了比较，结果表明煎煮时间、煎煮方式对含量影响较大[1],王跃生等用分光光度计，以535nm为检测波长、1,8-二羟基蒽醌为标准品考察了10种煎煮方法溶出的蒽醌含量的差异[2];万龙海等以525nm为检测波长、1,8-二羟基蒽醌作标准品，用分光光度法比较了2种煎煮方法溶出总蒽醌量的差异[3]；蒋孟良等考察了四种提取方法及不同的提取时间对总蒽醌含量的影响，结果表明含量高低顺序依次为粗粉醇提>醇提>渗流>水提，时间以1小时为佳，提示溶剂及提取时间对其含量为影响[4].苟奎斌等利用超临界流体萃取法用于大黄素的定量测定研究[5]；郭孝武研究了超声频率对提取大黄蒽醌成分的影响[6]。苏子仁等报道在酸性环境中结合蒽醌可能水解生成苷元和糖，大黄素在煎煮过程中受湿热的作用可能发生了自由基氧化还原反应，生成烷烃、高级脂肪醇、甾醇等已无药理活性的分解产物，且不排除受环境pH值的影响[7-8]；曾惠芳等报道大黄中结合蒽醌及游离蒽醌的稳定性可能受湿热作用的影响，且大黄素甲醚及其苷类可能转化，从而使游离大黄素和结合大黄素含量增加，提出在酸性环境中结合蒽醌可能发生了水解[9]；苏子仁等报道了大黄提取液在蒸馏、蒸发、干燥过程中，大黄素含量逐渐降低，其主要影响因素是水和热[10]。

上述这些研究对含大黄制剂的提取工艺、成型工艺的质量控制非常有意义。

2高效液相色谱的相关概述

2.1色谱分离法原理

色谱法原理是根据物质分子在流动相和固定相中的分配系数差异而产生差速迁移而实现的分离方法。以吸附色谱为例说明其分离原理：

吸附色谱是用吸附剂作为固定相，吸附剂的表面积比较大，在其表面有许多吸附中心，可以吸附不同极性的物质分子，这样当混合物通过固定相时，极性与吸附剂相同、相似的物质分子被吸附的能力强，被流动相洗脱的速度慢，流出色谱柱的时间晚，相反的极性与吸附剂相差大的流出的速度快，这样物质分子就按其极性的大小排列分离。

同样，其它机制的色谱按物质分子的其它各方面物理、化学等性质进行分离：分配色谱按固定相对物质的溶解程度分离物质分子，离子交换色谱按阴离子或阳离子的交换能力分离，空间排阻色谱则按分子的大小对物质分子进行分离。色谱法最基本的条件是根据被分离物质的性质选出合适的固色定相、流动相从而使被测组分从混合物中完全分离出来。

2.2高效液相色谱技术(HPLC)

高效液相色谱技术是更优化的液相色谱法，它在经典柱色谱的基础上引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵、高效填料和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。它还是根据物质的相似相溶原理，可使物质分子高效色谱柱，用流动相对其进行洗脱，对物质进行分离，然后用紫外检测器检查其响应值，对分离开的物质进行定量分析。目前最常用的是反相高效液相色谱（HPLC），下面介绍一下其色谱性能：

2.2.1固定相

HPLC改进了色谱柱填料的结构，提高了柱性能和填充的均匀性。

首先，它选用了球形的、颗粒细、均匀、耐高压的填料作载体，常见的是薄壳型、全多孔微粒型吸附材料，这就避免了常规柱色谱中填料不均匀，不紧密而造成的区带扩散等不佳的分离现象。

另外，它是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到载体表面，现在以硅烷化键合型反应最为普遍，经键合后的固定色谱性质也可分极性、非极性和离子性三类，反相高色谱是流动相的极性大于固定相极性的色谱，所以HPLC采用十八烷基、辛烷基、苯基等做非极性基团做固定相，这样改变了常规色谱中固定液流失分离效果差的缺点，并且有较高的耐压性，化学、热稳定性好，可高压匀浆装柱，大大提高了色谱法的柱效、灵敏度。

2.2.2流动相

除了柱效的改进，流动相的种类和配比对分离效果也有很大影响，一般采用与固定相不发生反应、不相互溶解的液体作流动相，其极性选择跟常规柱色谱的选择原则一样，目前HPLC中最常用的流动相体系是甲醇-水，乙腈-水，对一般的药物可先考察前者对其的分离性能，如改变甲醇和水的配比，适当填加适量离子对试剂如十二烷基磺酸钠等，与极性药物结合成中性分子，在色谱柱上保留时间增大，改善其峰型和分离度，如果仍得不到满意的效果，可改用乙腈-水体系重新考察其分离效果及响应值。

2.2.3检测器

经典柱色谱只实现了药物的分离，HPLC选择了高灵敏的检测器对分离结果进行考察和处理，最常见的是紫分检测器，被分离的药物组分常用共轭双键或芳环等基团，对特定波长处的紫外光有吸收，这样可同时对分离组分进行定性和定量分析，直接得到有效信息，上述两种流动相体系的紫外吸收波长多小于200nm，一般不影响普通药物组分的检测。

综上所述，液相色谱法普遍用于各类复杂物质的分离，而HPLC技术具有高效、高速、高灵敏度、适用范围广、流动相选择范围宽等优点，近年来发展特别迅速，在一些发达国家如美国，HPLC作为含量测定方法已超过容量法及其它仪器分析法的使用，其使用频率仍在不断上升，高效液相色谱法不仅可用于药品的分析、药物制剂分析，而且还可以用于药代动力学、生化分析、中草药有效成分分析及临床研究等领域中，发展潜力很大。

3反相高效液相色谱法测定游离蒽醌含量的研究

3.1仪器与试药

HP1100Series高效液相色谱仪(AgilentTechnologies,USA，配置HPG1311A四元梯度泵，HPG1315A二极管阵列检测器，HPG1313A自动进样系统，HP61313真空在线脱气机，HPG1316A柱温箱及HPChemStation6.0色谱工作站。

大黄、芦荟大黄素、大黄素等都是由中国医药生物制品研究所购买的;从陕西省宝鸡市大黄药材栽培基地取掌叶大黄CRhezanpalmatumL.)。乙腈为色谱纯，其余为分析纯。

3.2方法与结果

3.2.1供试品溶液的制备

先精密称取大黄不同工艺提取物适量(约含生药0.59)置于具塞三角烧瓶中，加入C}ICI}20mL，超声提取30min,过滤，滤液备用。残渣加2.5mol/LHZS0415mL振荡使其溶解，直火加热1h，待冷却至室温后，加入CHC1315mL，回流30min,冷却后吸取CHC13液，此过程重复4次，合并CHCI:液，并将蒸馏水洗至中性，与水解前CHCI提取液合并，回收CHCI若干，其残渣中加甲醇定容至10mL，备用，进样前用0.20gym滤膜过滤。

3.2.2对照品溶液的制备

精密称取1,8-二轻基蒽醌的对照品适量后，加入甲醇制成每毫升含0.208mg的溶液，备用。

3.2.3显色剂的制备

称取一定量的醋酸镁，用甲醇配制成0.8%的醋酸镁-甲醇溶液来作为显色剂。

3.2.4检测波长的确定

取1，8-二轻基蒽醌的对照品溶液1mL蒸干溶剂，再加上0.8%醋酸镁甲醇定容于25mL量瓶中，以0.8%醋酸镁甲醇溶液作为空白对照，参照紫外可见分光光度法，在200-800nm的波长范围内对对照品溶液进行扫描。结果发现，对照品溶液在515nm处有最大吸收，因此选择515nm作为检测波长。

3.2.5标准曲线的绘制

分别精密移取1，8-二轻基蒽醌对照品溶液0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0mL至25mL量瓶中，再蒸干甲醇，在25mL量瓶中加入0.8%醋酸镁甲醇溶液定容，用紫外可见分光光度法，在515nm波长处测定吸光度(A)，结果见表1。其中以浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为R2=0.9993，A=0.0372-0.0163。结果对照品溶液在1.66-16.64mg/L浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

表1：不同浓度对照品溶液的吸光度

浓度/(mg/L) 1.66 4.99 8.32 11.66 14.98 16.34

吸光度/A 0.045 0.165 0.298 0.421 0.547 0.595

3.3总蒽醌的含量测定

3.3.1供试品溶液的制备

取大黄生品以及大黄不同炮制品约0.05g,精密称定后，加氯仿30mL及12.5mol/L硫酸溶液15mL，沸水浴回流水解2h，收集氯仿层，水浴蒸干后，残渣加入甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，精密吸取1mL于10mL量瓶中，用0.8%醋酸镁一甲醇溶液定容即可。

3.3.2精密度考察

精密吸取3.3.1项下制得的供试品溶液1mL于10mL量瓶中，加0.8%醋酸镁甲醇溶液定容。摇匀后于515nm处重复测定5次并记录吸光度值，计算RSD。结果RSD为0.32%，该实验表明仪器精密度良好。

3.3.3稳定性考察精密吸取

3.3.1项下制得的供试品溶液1mL于10mL量瓶中，加0.8%醋酸镁甲醇溶液定容。在515nm下分别为0.15，30，60，120min进行测定并记录吸光度值，计算RSD。结果RSD为2.33%，实验结果表明供试品溶液在2h内稳定性良好。

表1：精密度试验结果

名称峰面积 RSD（%）

芦荟大黄素 517.84 514.71 513.83 516.71 519.86 516.7 0.1

大黄素 486.85 489.68 488.01 488.91 488.83 487.90 0.13

大黄酚 517.84 516.61 518.30 517.84 516.83 518.24 0.03

大黄素甲醚 483.78 481.83 49.6 49.3 48.9 48.7 0.14

大黄酸 46.5 46.1 46.4 46.1 46.3 46.3 0.03

3.3.4重复性考察

取大黄炭品粉末5份，按3.3.1项下制备方法进行制备，精密吸取1mL于10mL量瓶中，加0.8%醋酸镁甲醇溶液定容。摇匀后于515nm处进行测定并记录吸光度值，计算RSD。结果总含量平均含量为1.2972%，RSD为1.54%，表明该方法重复性好。

表2：重复性试验结果

名称峰面积 RSD（%）

芦荟大黄素 117.0 116.4 118.1 119.2 118.5 117.1 0.83

大黄素 151.82 147.93 149.78 149.5 148.93 147.98 0.71

大黄酚 483.3 480.6 483.1 48.7 486.1 485.1 0.42

大黄素甲醚 137.94 13.84 140.69 104.8 141.0 14.6 0.76

大黄酸 11.76 118.0 119.13 119.6 119.94 10.5 0.98

3.3.5总蒽醌含量测定

供试品溶液吸取1mL于10mL量瓶中，加0.8%醋酸镁甲醇溶液定容。摇匀后，用紫外分光光度仪测定吸光度，计算总蒽醌含量，结果表明大黄炒炭后总蒽醌含量均有所降低。见表3。

表3：样品中总蒽醌含量

样品 1# 2# 3# 生大黄

总蒽醌含量/% 1.3202 1.2792 1.0626 1.5042

3.4游离蒽醌的含量测定

3.4.1供试品的制备

取样品1.0g,精密称定，加氯仿30mL，回流提取2次后合并滤液，水浴蒸干氯仿，备用。

3.4.2精密度考察取

3.4.1项下供试品，用甲醇溶解加0.8%醋酸镁甲醇溶液显色并重复测定5次，记录吸光度，计算RSD值。结果RSD为0.20%，该实验表明仪器精密度良好。

3.4.3稳定性考察取

3.4.1项下供试品，用甲醇溶解加0.8%醋酸镁甲醇溶液显色，分别于15，30，60，120min进行测定并记录吸光度，计算RSD值。结果RSD为0.43%。该实验表明供试品溶液在2h内稳定性良好。

3.4.4重复性考察

取大黄炭品粉末5份，按3.4.1项下供试品制备方法制备，加0.8%醋酸镁甲醇溶液显色后，用紫外分光光度仪进行测定并记录吸光度，计RSD值。结果游离蒽醌含量为0.93%，RSD为2.53%，该实验表明本方法重现胜良好。

3.4.5游离蒽醌含量测定取

3.4.1项下供试品，用甲醇溶解，加0.8%醋酸镁甲醇溶液显色后，用紫外分光光度仪进行测定并记录吸光度，计算游离蒽醌含量及结合蒽醌含量，结果表明大黄炒炭后根据炒炭程度不同，所含有的游离蒽醌含量不同，见表4。

表4：样品游离蒽醌及结合蒽醌含量%

样品 1# 2# 3# 生大黄

游离蒽醌含量 0.98560.96930.92590.8155 0.98560.96930.92590.8155 0.98560.96930.92590.8155 0.98560.96930.92590.8155

结合蒽蒽醌含量 0.33460.32790.13670.6887 0.32790.32790.13670.6887 0.13670.32790.13670.6887 0.68870.32790.13670.6887

4讨论

4.1游离型蒽醌

蒽醌类化合物是大黄的主要成分，其中游离型蒽醌主要为芦荟大黄素(alo-emodin）、大黄酸(rhein)、大黄素（emodin）、大黄酚（ohryeophanol）、大黄素甲醚(physcion)等;结合型蒽醌为蒽醌衍生物与葡萄糖结合成的苷，番泻苷(Sennoside)A-F等[5]。在大黄组分的药代动力学研究中，文献报道了单体以不同方式的代谢。到目前为止，研究发现，大黄在代谢过程中对代谢过程的影响，口服大黄汤后，从大鼠尿、胆汁和血液中检测到113种成分。大黄中的主要成分大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚单体给药后体内吸收速度较快，与血浆蛋白结合率较高，通过化合物原型转化芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚在体内的吸收，将是大黄酸的代谢产物。

4.1.1芦荟大黄素

实验研究发现小鼠腹腔注射给予芦荟大黄素20mg/kg，体内血药浓度最大值为654.6ng/mL；大鼠口服灌胃4.5mg/mL后发现，在H1.5-3范围内血药浓度达到最高，与最高值在不同性别大鼠体内有248ng/mL，在雄性大鼠差异，并在雌鼠体内高达441ng/mL[6]。给药后血液中原型成分仅占10%，其进入体内后迅速代谢为3种产物，其主要成分是大黄酸，另外为一种未知成分与一种缀合物;组织分布研究发现芦荟大黄素在肾、肝、小肠中的浓度明显高于血液，同时发现在大鼠肇丸中浓度明显低于卵巢。

4.1.2大黄酸

大黄酸在体内的原型为基础，在尿液和胆汁中检测到两个代谢产物，由于成分可酶葡萄糖酸和硫酸酷酶水解；因此，大黄酸缀合物的判断。大黄给药后，血液吸收率很快。口服给药后，5min是测定血清，它可以检测出体内。大黄酸在雄性大鼠静脉注射或静脉注射后48h内可测定血中大黄酸的含量；在组织中静脉注射给药2d后仍可检测到大黄酸;口服给药7d后仍可检测到。单次肠道内给药大黄酸25mg/kg采集2d内尿样及粪样，大黄酸在尿液中回收率为37%，粪便中为53%。在组织中的血药浓度明显低于血液，以脑组织和肇丸最低，在肾脏中浓度最高。

4.1.3大黄素

对家兔静脉注射大黄素检查。研究发现其体内代谢过程属于二室开放模型，AUC518ng/mLmin，消除半衰期为227min；口服给药后，大黄素在血液中浓度较低，使用平衡透析法测定大黄素与血浆蛋白结合率，其结合率较可达到99.6%。

4.1.4大黄酚

在家兔耳缘静脉注射大黄酚10mg/kg静脉注射后，体内代谢过程更符合二室模型，分布较为迅速，T。为9.6min，,为139.27min，远大于T，说明兔耳缘静脉注射大黄在体内消除过程的基础。

4.1.5大黄中结合型蒽醌

结合型蒽醌以番泻苷为主，是大黄蒽醌类衍生物以及蒽醌与葡萄糖结合形成的苷类。然而经口服给药后在血液中并未检测到这类结合型蒽醌类衍生物，检测到的为水解糖基后的苷元。大鼠口服番泻苷2.3h后，于肠内检测到等摩尔的芦荟大黄素蒽醌以及大黄酸蒽醌。抗生素给药后，由于肠道菌群的变化，总的绿酮总量有所减少。大黄蒽醌类化合物分子氧葡萄糖口服后被肠道菌群代谢生成平台，吸收后再与葡萄糖醛酸和硫酸冷却形成结合物。因此证明蒽醌碳苷和双蒽醌氧苷进行治疗时其发挥作用的成分为水解后苷元的部分。

4.2蒽醌类衍生物的药理作用

4.2.1对中枢神经系统的影响

大黄素具有抗炎作用，欧阳瑜等研究了大黄素对白三烯B4和PGE2生物合成的影响，结果表明大黄素具有抑制LTB4的合成，抑制作用强度随大黄素浓度增高而增强，对PGE2合成无抑制作用.

4.2.2对心血管系统的影响

1988年SupniewskiTV等报道，大黄素对动物有降低血压的作用，其降压作用与剂量有相关性，随大黄素的剂量加大，而降压作用增强.

4.2.3对泌尿系统的影响

周晓明等研究中发现大黄蒽醌衍生物对家兔有利尿作用和肾髓质Na+-K+-ATP酶活性有抑制作用，大黄素、大黄酸对家兔排尿、排Na+和排K+明显抑制作用，其利尿作用与排Na+作用呈良好线性关系，大黄素、大黄酸和芦荟大黄素对Na+-K+-ATP酶活性都有很强的抑制作用。蒋工伟等在研究大黄对体外肾小球系膜细胞生长的影响中发现将大黄蒽醌和大黄酸蒽。酮葡萄糖苷加入培养液中，可直接抑制系膜细胞生长。

4.2.4对消化系统的影响

有研究表明大黄泻下的有效成分为蒽醌类衍生物，以蒽酚(酮)的苷泻下效力较强，游离蒽醌较弱，游离蒽醌最弱.孙阳等发现大黄蒽醌衍生物对小鼠肝微粒体细胞色素P-450具还原作用，影响肝脏药物氧化代谢功能。焦东海等报道大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对与急性胰腺炎发病直接有关的五种胰酶(胰蛋白酶、胰弹性蛋白酶、胰磨蛋白酶、胰激肽释放酶、胰脂肪酶)具有明显的抑制作用。

4.2.5对呼吸系统的影响

张效禹等用大黄总蒽醌苷元20g/kg(按生药折算)即可使小鼠酚红排泌量较对照组明显增加，且随剂量加大而增多.故初步认为大黄的祛痰有效成分是蒽醌苷元。

4.2.6对免疫功能的影响

大黄蒽醌衍生物大黄酸、大黄素和芦荟大黄素对正常小鼠免疫系统有不同程度的’抑制作用，如减轻免疫器官的重量，减少抗体的产生，抑制碳粒廓清功能和腹腔巨噬细胞吞噬功能，降低白细胞数。

4.2.7抗菌作用

陈琼华等报道了大黄中各种蒽醌衍生物都有不同程度的抗菌作用，其中以大黄酸、大黄素及芦荟大黄素三者的抗菌作用较强，而大黄素甲醚加大黄酚及蒽醌本身的抗菌作用较差。吴家驹用组织培养法观察大黄及其蒽醌苷以病毒的灭活作用，结果表明蒽醌苷对肠道病毒有灭活作用。

此外，还有报道大黄蒽醌衍生物具有杭肿瘤的作用.有实验表明大黄-酸和大黄素均具有抗肿瘤的作用，尤其是对黑色素瘤有很强的抑制作用，对乳腺癌和艾氏腹水癌也有一定抑制作用.另有实验显示大黄素、大黄酸、芦荟大黄素和大黄酚对艾氏腹水癌细胞呼吸均有不同抑制作用，其中以大黄素的抑制作用最强，在同一时间内，抑制率随浓度增加而增加。路铭等研究蒽醌衍生物对小鼠P388白血病的影响中发现大黄酸和大黄素对DNA,RNA和蛋白质的生物合成的抑制作用较强，而芦荟大黄素作用较弱。

5结论

大黄的功效与蒽醌苷类成分密切相关，研究结果表明，大黄蒽醌成分远大于天然蒽醌苷元的量，其含量和总可以同时作为质量评价大黄。其含量标准尚需结合多产地、多批次的药材含量测定结果而定，本文以大黄为例，建立了用高效液相色谱法测定这些制剂中主要有效成分的含量，此法简便、快捷、准确，重复性好，可以为此类药品的质量控制提供直接的依据。本课题对大黄中的主要有效成分进行定量分析，其研究成果将直接反应出该制药剂的质量，同时为自制制剂的质量控制提供有效、准确的数据为参考。

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